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Cell Rep:清华大学陈春来课题组揭示CRISPR/Cas9蛋白切割DNA过程中的调控和校验机制

摘要 : 2018年1月9日,国际著名学术杂志《Cell》子刊《Cell Reports》杂志在线发表了清华大学生命科学学院陈春来研究组的一篇研究论文,论文展示了Cas9可以自发地在三种主要构象中转换,揭示了Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用可长程别构调控Cas9切割结构域的局部构象
2018年1月9日,国际著名学术杂志《Cell》子刊《Cell Reports》杂志在线发表了清华大学生命科学学院陈春来研究组的一篇研究论文,论文展示了Cas9可以自发地在三种主要构象中转换,揭示了Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用可长程别构调控Cas9切割结构域的局部构象,这是Cas9切割靶标DNA之前的最后校验步骤。最后,该文提出了优化和设计高保真Cas9的新思路,即通过突变Cas9蛋白以影响这种长程别构调控机制,可提高Cas9的识别特异性。研究论文题目为“The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET”(利用单分子FRET揭示Cas9在DNA切割过程中的动态构象)。清华大学生命学院博士生杨梦铱,彭思佳为共同第一作者,陈春来研究员为本文通讯作者。 CIRSPR/Cas9是一种可以由一条单链sgRNA(single guide RNA)指导的利用Cas9核酸酶对靶向DNA进行特异性识别和切割的技术。由于其可以高效快捷地靶向切割DNA而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是,Cas9的脱靶效应严重阻碍了其应用。尽管有一些研究报道了通过改造Cas9和截短sgRNA来提高其特异性,但仍然缺乏对Cas9切割靶标DNA的详细分子机制的全面认知,因而难以对CIRSPR/Cas9的优化提供系统性的指导。 单分子荧光共振能量转移技术(FRET)是检测生物大分子构象变化的有利工具。该研究通过在Cas9蛋白的特异位点上标记荧光团,基于全内反射荧光显微镜快速灵敏地捕捉单个Cas9分子的FRET效率变化以及在每个FRET状态的停留时间,以此反应Cas9的构象变化,并提供该过程中的一系列动力学参数。该研究发现,Cas9展现出三种构象状态,并可以自发的在这三种状态中自由切换。靶标序列的PAM远端与sgRNA的大于三个碱基的错配,导致Cas9的HNH结构域(核酸切割结构域)稍偏离了其正确切割位点,因而将其从切割活性态转化为非活性状态。而这种对错配的校验机制是Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用对其HNH结构域的长程别构调控来实现的。 通过对Cas9一些高保真突变体的研究,该文章证明了在Cas9/RNA/DNA三聚复合物中引入额外的能量损耗导致Cas9切割底物的能垒升高,从而提高了Cas9切割特异性。该文章为优化Cas9特异性提供了新思路,即通过减弱Cas9与PAM远端DNA/RNA异源双链的相互作用来提高切割能垒,从而达到提高特异性的目的。 01_10_01 图.Cas9蛋白切割靶标DNA的动态动态构象和校验机制模型 原文链接: The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET 原文摘要: Off-target binding and cleavage by Cas9 pose major challenges in its application. How the conformational dynamics of Cas9 govern its nuclease activity under on- and off-target conditions remains largely unknown. Here, using intra-molecular single-molecule fluorescence resonance energy transfer measurements, we revealed that Cas9 in apo, sgRNA-bound, and dsDNA/sgRNA-bound forms spontaneously transits among three major conformational states, mainly reflecting significant conformational mobility of the catalytic HNH domain. We also uncovered surprising long-range allosteric communication between the HNH domain and the RNA/DNA heteroduplex at the PAM-distal end to ensure correct positioning of the catalytic site, which demonstrated that a unique proofreading mechanism served as the last checkpoint before DNA cleavage. Several Cas9 residues were likely to mediate the allosteric communication and proofreading step. Modulating interactions between Cas9 and heteroduplex at the PAM-distal end by introducing mutations on these sites provides an alternative route to improve and optimize the CRISPR/Cas9 toolbox. 来源: Cell Reports 浏览次数:0
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