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原位杂交实验操作步骤

摘要 : 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中,37℃、100rpm培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌,冰浴30min,离心
质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mllb培养基的锥形瓶中,37℃、100rpm培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌,冰浴30min,离心,弃上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌,分装(200μ/tube),-80℃保存。 2.转化:在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻,将浓度为2ng/μ1的质粒dna4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀,冰浴30min。 4.42℃热激9O秒,然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml,在37℃,100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落,接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中,于37℃,200转/分培养2h,取1ml之一eppendorf离心管,加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振荡30秒。 3.在70℃温育5min,然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液,振荡3O秒后,冰浴5min。 5.12000g,4℃离以3min,以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到样品孔中,其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V,进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时,停止电泳,在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。 1.3质粒的扩增和纯化 1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中,于37℃,200转/分培养3h。 2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中,37℃,200转/分培养过夜(12-16h),细菌浑浊。 3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液,终浓度为170μ/ml)。37℃,200转/分培养12-16h。 4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中,6000rpm,4℃离,th,15min,沉淀细菌。 5.弃净上清夜,用2ml预冷的溶液I,悬浮菌体沉淀,剧烈振荡,于室温静置5min 6.加入新配制的溶液II4ml,快速用手晃动10秒,颠倒数次后,于室温静置10min。 7.加入预冷的溶液III3ml,温和振荡l0秒,于冰上静置10min,出现白色絮状沉淀。 8.6000rpm,4℃离心15min,保留上清。 9.将上清(若带细菌残片,则再次离心)移入另一50ml的离心管中,加入0.6倍体积的异丙醇混匀,于室温静置10min。(或-20℃4h,或4℃过夜,可便核酸沉淀) 10.12000rpm,4℃离心15min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残兼上清液流尽。 11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000rpm离心,15min,充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。 12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀,转移至1.5mlEppendorf管中。 13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl,充分混匀。12000rpm,4℃离心15min,以沉淀高分子量的RNA。 14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中,加等量异丙醇,充分混匀,于室温静置10min。 15.12000rpm,4℃离心15min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残余上清液流尽。 16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000rpm离心,15min,充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。 17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中,室温放置1.5mlEppendorf管中30min。 18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L),混匀,4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA,弃去上清。 19.加入400μlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀,再分别用等体积的Tris饱和酚、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、和氯仿各抽提一次。 20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中,加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇,充分混匀后于4℃放置30min。 21.于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清,敞开管口,置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。 22.加入400μl处于4℃的70%乙醇,稍加振荡,漂洗沉淀,4℃12000rpm离心2min。 23.吸去上清,室温敞开管口,直到乙醇完全挥发。 24.用100μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。 25.取4μl溶液1:100稀释后,测定其OD260、OD280,以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为 1.8,高于2.0则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(μg/μl)。 26.质粒DNA溶液于-20℃保存待用。 二、cRNA探针的标记 1.将质粒DNA,用相应的限制性内切酶线性化,通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。 2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化,作为cRNA探针标记的模板,用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。 3.进行体外转录,步骤如下: 4.在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。 三、原位杂交 3.1冰冻切片与杂交前预处理 1. 将子宫样品从-80 ℃取出,用OCT包埋,在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡 至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上,切10μm厚的连续组织 切片,平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干 烤6小时),保存于-70 ℃冰柜备用。 2. 冰冻切片经室温干燥10 min后,在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO min。 3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次,每次5 min。 4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后,重复步骤4)。 5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1),37 ℃孵育15 min,重复步骤4)。 6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后,再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA (乙酸酐/三乙醇胺,pH 8.0)中乙酰化10 min。 (在大多数实验中,步骤4,5,6省略) 7. 5 x SSC中平衡15 min。 3.2杂交 8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片),置于放有湿盒液(50% 甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl,pH 8.O)的湿盒中, 55~58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。 9. 甩掉预杂交液,地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经 70 ℃变性1O分钟,置冰上1 min,玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片), 覆盖parafilm膜,放湿盒中在48~58 ℃下杂交18-30 h。 3.3杂交后处理 1O.取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉杂交液,用52 ℃预热的5×SSC洗 30 min。 11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。 12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC,1 X SSC和O.1 X SSC洗2次,每次30 min。 3.4杂交信号检测 13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5,0.15M NaC1)中平衡5min。 14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1:500~1:2000稀释于含0.5% 阻断液的缓冲液A中),室温反应2h。 15.用缓冲液A洗2次,每次15 min。 16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2,pH 9.5)中平衡5 min。 17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B 中,每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染 液在湿盒中显色过夜。 18.充分显色后,用EDTA(1 mM EDTA,pH 8.0)洗15 min终止反应。 19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。 20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。 21.脱水、透明,用中性树胶封片。 22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。 作者:青岚 点击:
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