当前位置:生物帮 > 实验技巧 > 核酸技术 > 正文

掌握斑马鱼总RNA的提取实验方法

标签: 斑马鱼 RNA提取
摘要 : 实验一 斑马鱼总RNA的提取【实验目的】 1、掌握提取总RNA的原理和技术。 2、学习和掌握控制RNA酶活性的方法。 【实验原理】 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的,而且是进行基因表达分析的基础。在总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核甘酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成。mRNA一般只占总RNA的1%左
实验一 斑马鱼总rna的提取

【实验目的】 1、掌握提取总RNA的原理和技术。
2、学习和掌握控制rna酶活性的方法。
【实验原理】 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的,而且是进行基因表达分析的基础。在总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核甘酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成。mRNA一般只占总RNA的1%左右,而且由于RNA酶(核糖核酸酶,RNase)广泛存在、活性稳定,其反应也不需要辅助因子,因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就难以获得完整的RNA;而所制备的RNA的纯度和完整性又直接影响着RNA分析的结果,长度大于4kb的转录本本身存在的几率更小,其对于痕量RNase的降解也比小转录本更敏感,所以RNA的制备与分析操作难度极大,克隆长片段的基因更加是一门艺术。总之在所有RNA实验中,归根结底就是防止RNA酶的污染,分离到全长的RNA。 在实验中,一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。因为各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶,所以所有分离提取RNA的方案都是在能导致RNA酶变性或失活的化学环境中使RNA释放出来。另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而为避免RNA酶的污染,实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需特别处理。 近年来,常用的RNA酶抑制剂主要有:(1)异硫氰酸胍。异硫氰酸胍是目前被认为最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。(2)焦碳酸二乙酯(DEPC)。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。DEPC通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性,使用浓度为0.05-0.1‰。(3)钒氧核糖核苷复合物。由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,因而能百分之百地抑制RNA酶的活性。其使用浓度为10 mmol/L。(4)RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)。是一种从大鼠肝或人胎盘中分离出来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶紧密结合形成复合物从而使其失活。(5)其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。本实验采用DEPC对实验中所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等进行处理。 总RNA制备的方法很多,如1)异硫氰酸胍-苯酚法,许多公司有现成的总rna提取试剂盒(如Trizol试剂盒,其实质也是异硫氰酸胍-苯酚法),从而可快速有效地提取到高质量的总RNA。2)超离心方法,可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长,要求离心过夜。3)其它一些试剂盒,主要是利用某些特定的介质吸附RNA,驱除其它杂质以后,将纯净的RNA洗脱下来,这样就可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。 目前,最常用的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。异硫氰酸胍-苯酚法的基本过程是:先将样品(以动物的腺体或组织为例)放进匀浆器中加入异硫氰酸胍变性液进行匀浆裂解,再用酸性苯酚(水饱和酚)、氯仿抽提除去DNA和变性的蛋白质,最后用异丙醇沉淀出RNA。Trizol试剂法进一步提高了RNA的提取能力,可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。该法甚至可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。本实验就简单介绍Gibcol公司的产品Trizol Reagent(Total RNA Isolation Reagent)的使用方法。不同公司的RNA提取试剂盒具体的使用方法略有不同,可参照产品使用说明书。 此外,不同组织中提取的RNA,其中残留痕量RNase污染的几率也不同,为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃(用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物)。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。 【试剂与器材】 (一)试剂
1、灭菌的DEPC水:量取一定体积的三蒸水,加入0.05-0.1‰的DEPC,磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜,121℃高压蒸汽灭菌50分钟,冷却后,作为试剂配制用水。
2、变性液 (500mL)
4.0M 异硫氰酸胍236.32g
0.015 M醋酸钠,pH7 1.02g
20mM 巯基乙醇 0.7mL
0.5% Triton X-1002.5mL
0.5% NP 40 2.5mL
0.25% 异戊醇1.25mL
3、水饱和酚
用DEPC处理过的水饱和重蒸酚:取适量重蒸酚,加等体积的DEPC处理水,磁力搅拌器搅拌过夜,经常更换上层的水,直到pH为4.0—5.0之间。上层仍用水覆盖,置于4℃冰箱保存。
4、氯仿:异戊醇(24:1)
5、异丙醇
6、75%乙醇
7、2M NaAc(pH4.0)
(二)器材
1、烧杯(1000,500,100,50mL若干),
2、量筒(1000,500,250,50,20 mL若干),
3、玻璃棒,药勺,试剂瓶,三角瓶。
上列器皿均用锡箔纸密封,然后置180℃干烤5小时。
4、枪头(1000、200、20 μL),枪头盒。
5、离心管 (1.5mL、2mL、7mL离心管),
上列塑料制品均用含0.05-0.1‰ DEPC的水浸泡过夜。
6、冷冻高速离心机
7、紫外分光光度计
【操作方法】 (一)异硫氰酸胍-苯酚法
1)处理样品:引颈处死小鼠,剖腹切取肝脏组织100mg-150mg,加入1.0ml-1.5ml变性液,置于匀浆器中进行匀浆。
2)将匀浆后的组织样品(含变性液)移至7mL离心管中,加入0.1倍体积的2M NaAc (pH4.0),加盖并轻轻颠倒混匀。
3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混匀,用力振荡10秒钟,然后冰上放置15min。
4)4℃,10,000g,离心20min。
5)小心吸取上层水相至一个新的离心管。注意不要吸出中间层(该层富含蛋白质和DNA)。
6)加等体积预冷的异丙醇与样品混匀,置-20℃ 30分钟以沉淀RNA。对于RNA含量很少的样品可沉淀过夜以提高回收率。
7)4℃,10, 000g,离心15分钟沉淀RNA。
8)弃上清,将RNA沉淀重新悬浮于适量变性液中,置于旋转摇床上多角度摇晃至RNA溶解,也可加热到65℃促进溶解(时间尽可能短)。
9)重复步骤2-6。
10)弃上清,加预冷的75%乙醇,洗涤沉淀;4℃,10, 000g,离心15分钟,弃上清。
11)真空或室温干燥使样品中的乙醇挥发殆尽,但不宜过分干燥,否则沉淀难以完全溶解。
12)将RNA溶于20-50 µl无RNA酶的去离子水中。
用紫外分光光度计测定样品在260nm、280nm波长的光密度并初步估计浓度和纯度。 计算浓度:OD260为1时,为40ug RNA,
样本RNA含量(ug/ul)= OD260*稀释倍数*40/1000
纯度:纯RNA样品的A260/A280比值为1.8~2.0,
当OD值260/280<1.8时,提示有蛋白或酚的污染,要重新用酚/氯仿抽提。
13)电泳检测总RNA的纯度(见下一实验)。
(二)Trizol Reagent 处理法(参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒)
1)处理样品:引颈处死小鼠,剖腹切取肝脏组织50mg(或106-107个细胞),以1 ml Trizol Reagent处理50-100mg的组织样品(或0.25ml的液体组织样品)的比例加入Trizol液,剪碎,快速匀浆。
2)取1.5 ml 的Trizol Reagent处理的组织样品于2 ml 离心管中,15-30℃,静置样品5分钟(min)使核蛋白解聚。
3)加入0.4 ml氯仿,用手强力振荡15秒,15-30℃静置3-15分钟(min)。
4)2-8℃,低于12,000g(或15000转/分)离心15分钟。
5)将上层水相(约1ml)转移至另一个2 ml 离心管中,加入1 ml异丙醇混匀,15-30℃,静置10分钟。如果RNA量少,可以放置过夜。
6)2-8℃,低于12,000g(或15000转/分)离心10分钟。
7)弃去上清,加1ml 75% 乙醇洗沉淀。
8)2-8℃,低于7,500g(或10000转/分)离心5分钟。
9)弃去上清,尽量吸去乙醇。室温干燥5-10分钟(min)左右(不要完全干燥)。
10)加入适量无RNA酶的去离子水溶解RNA,保证充分溶解。
11)分光光度计测定浓度(同上)。
12)琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度(见下一实验)。
RNA溶液可置于-20℃保存备用。对于长期保存,应重新补加NaAc(pH4.0)至0.25M,再加2.5倍体积乙醇,-70℃保存。
【注意事项与提示】 实验要求创造一个无RNA酶污染的环境。主要包括两个方面的工作,其一,尽力抑制组织细胞中内源性RNA酶的活力,并尽可能地去除;其二,极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性RNA酶的污染。由于RNA酶到处存在,不易失活,极易造成污染而导致RNA的降解,造成实验失败。因此建议所有用品均应严格按要求消毒,注明RNA专用。严格按无菌操作要求操作。 (一) 防止各种试剂、设备中RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在泡酸反复冲洗后,于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再在室温下用3% H2O2浸泡10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
(二)操作过程中的防范措施
1.RNA酶最主要的潜在污染源为研究人员的手及唾沫等。因此,凡与RNA的提取有关的一切物品,切记戴手套取之,勿用手直接接触;而且,在实验过程中要勤换手套。
2.实验台、微量取样器和离心机等实验用具应用75%的乙醇擦拭干净。
3.DEPC有致癌之嫌,需小心操作。戴双层一次性手套,一次性口罩以防之。
4.必须保证塑料制品被DEPC水浸透,内部没有气泡,对于枪头和离心管,必要时应用枪逐个用水灌注。
5.用镊子逐个敲去离心管内的DEPC水,装于干烤过的烧杯,用牛皮纸封住杯口,外加锡箔纸密封;尽量敲去枪头内的水,装于处理过的枪头盒,报纸包好。高压蒸汽灭菌50分钟。
6.实验中可用DEPC处理的试剂和容器,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再高压灭菌以消除残存的DEPC,以免其日后抑制其它酶的活性,导致实验失败(DEPC能和腺嘌呤作用而破坏相关的酶的活性以及mRNA活性)。另外,DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
7.Trizol Reagent处理的组织样品加入氯仿处理离心后,分成三层:上层为RNA,中层白色为变性的蛋白质,下层为基因组DNA。故移取上清时注意轻缓,不要旋起中间层、以免吸出其中的蛋白质和DNA杂质。
(三)RNA提取各步骤中应把握的细节
1.实验过程中应将组织充分匀浆,一般可先将组织块用剪刀剪碎,以利于快速匀浆。
2.抽提过程中,由于异硫氰酸胍是RNA酶的强抑制剂,在整个实验过程中不会产生RNA的降解。但在加入75%乙醇洗涤时,以及RNA干燥和加水溶解时须防止RNA酶的污染。
3.去除内源性RNA酶的方法一般是用酚/氯仿反复抽提,直至中间的蛋白层基本消失。在酚/氯仿抽提过程中,一定要颠倒混匀充分,这样才能使蛋白质充分变性,才能充分去除蛋白质与RNA酶。为了提高RNA的纯度,我们的经验是至少抽提3次以上。
4.在吸取上清时,切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起,造成RNA的污染。因此,通常轻轻吸取上清,且留有部分上清,以免搅起紧邻着的酚。
5.若需抽提大量RNA时,以上试剂、试管可按比例放大。所获RNA建议分装,以免使用过程中反复冻融。
6.如果是培养细胞,先收集细胞,用PBS缓冲液反复漂洗3次,再加Trizol溶液混匀细胞,后面的实验过程一致。
【实验安排】 第一天:处理实验所用的玻璃、塑料用品和配DEPC无菌水、水饱和酚;
第二天:高压灭菌所浸泡的塑料用品以及配变性液;处理组织样品,并进行实验至步骤5):放置过夜;
第三天:完成实验并进行总RNA的质量检测:光吸收法和琼脂糖凝胶电泳法。
【实验报告要求与思考题】 1、计算出所提取的总RNA的A260/A280值以及浓度。
2、写出3种常用的RNA酶的抑制剂及其作用机理。
附:紫外分光光度计的使用方法
1、使用前,打开电源,预热30分钟以上。
2、激发氢灯,至指示灯发亮(电源旁边的按钮)。
3、关上顶盖。将A/T旋钮打到T,调节到100.00。打开盖,调节到0.00。
4、装0.2 ml无菌水于微量比色杯中,重新调零。
5、加样品稀释至0.2ml无菌水,颠倒混匀,置于比色杯中。
将A/T旋钮打到A,测定其OD260
6、将刻度调到280nm,重新调零,读取OD280。
7、计算A260/280。根据公式计算浓度:
A260×稀释倍数×40(单链核酸)(微克/毫升)
A260×稀释倍数×50(双链核酸)(微克/毫升)
鉴定RNA纯度和浓度的方法
1)检测RNA溶液的吸光度
260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)。
当OD260/OD280的比值为1.8-2.0时,我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是<2.2的)。通过此时的A260值,即可换算出RNA的浓度。
当R<1.8时,溶液中蛋白或者是其他有机物的污染比较明显,可根据实验需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时,说明RNA已经水解成单核苷酸了。
A260/A230的比值还表明RNA的纯度,其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留,其值大于2.4,需用乙酸盐,乙醇沉淀RNA。
2)RNA的电泳图谱
一般的,RNA的电泳都是用变性胶进行的,但是根据近年的经验,如果仅仅为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的,用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,则认为RNA的质量是好的(见图1-1)。通过与标准浓度的marker进行比对也可以获知RNA的浓度。
以上是常用的两种鉴定RNA纯度和浓度的方法,但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶,用以上方法很难察觉,但是大部分后续的酶学反应都是在37℃以上并且是长时间进行的。如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用,而导致实验的失败。下面,介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留RNA酶的方法。
3)保温试验
从RNA溶液中吸取两份约1000 ng的RNA加入0.5 ml的离心管中,用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。随后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件),则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
通过了保温实验的检测并且在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶,实验应该是很难失败了!
  作者:网友 点击:
    热门文章TOP
    优发国际