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定量PCR Taqman探针设计要领

标签: 探针 PCR 定量 TaqMan
摘要 : 自90年代Taqman探针诞生以来,虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量PCR技术,Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选,这主要是因为相对于SYBR荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,Taqman探针只
自90年代Taqman探针诞生以来,虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量pcr技术,Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选,这主要是因为相对于SYBR荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,Taqman探针只要设计一条探针,因此探针设计较便宜方便,而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针,也给实验操作带来了挑战。 一般Taqman定量PCR实验过程为:目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验,优化条件→获得曲线数据,比对标准曲线→再重复验证。  第一步:在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过,这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig(重叠群,即染色体的一些区域中毗邻dna片段重叠的情况)内。  第二步:如果其它条件一致,那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了,通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则:
总体原则
* 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异,尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率,而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测,如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度
* 扩增长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片段越短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
* 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
* 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。  
引物设计原则 * 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
* Tm值在55-65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高),GC含量在40%-60%
* 引物之间的TM相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
* 为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp
* 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。  
探针设计原则 * 探针位置尽可能地靠近上游引物
* 探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性
* 检测探针的DNA折叠和二级结构
* Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%
* 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5"G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
* 整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
* 为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。  
Taqman MGB 探针设计 * 探针的5’端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
* Tm值应为65-67℃。
* 尽量缩短Taqman MGB探针,但探针长度不少于13bp。
* 尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
* 原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号)。因此,在进行SNP检测时,为了检测到突变子,即Taqman MGB不与目的片段杂交,不产生荧光信号,探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意:为了满足上述要求的4个条件,探针的突变位点可向3’端移动,但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守),以进行SNP检测。反过来,若要进行同类检测,找的是保守片段区,探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变,突变位点也应靠近探针的5’端,这样,即便是突变,探针也可与目的片段杂交,产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针,也可达到即使是突变,仍可检测到突变。  
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