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3.2 染色质免疫沉淀技术(ChIP)实验常见问题

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摘要 : 染色质免疫沉淀技术(ChIP)实验常见问题
一. 实验前准备: 1. 实验设计与分组 2. 实验试剂、耗材、仪器准备 3. 试剂盒:Pierce™ Agarosechip Kit 二. 实验开展:(以哺乳动物贴壁细胞为例) A. 交联与细胞裂解 1. 用15cm培养皿培养细胞,细胞量达80%-90%,细胞数量约为1x107 个,待用。 以下步骤基于1次ChIP试验 2. 交联:向每个含有培养液的培养皿中,加入16%的甲醛,使甲醛终浓度为1%. 轻轻晃动培养皿, 使混匀, 室温孵育10min.(交联时间很重要,过长影响ChIP结果,过短交联不完全,产生假阳性) 3. 终止交联:向上述培养皿中,加入10X的甘氨酸溶液使其终浓度为1X的。混匀,室温孵育5min。 4. 吸出培养皿中含有甲醛-甘氨酸的混合培养基。用1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。 5. 在1ml预冷的PBS加10ul的Halt Cocktail。然后将此混合液加入清洗后细胞中,再用细胞刮搜集细胞,将细胞悬浮液用移液器转移到1.5m的微管离心管中。 6. 将搜集的细胞于3000g离心5min。除去PBS,将细胞沉淀物保存在-80°,或者直接进行一下步骤:酶解 附:蛋白量检测:WB B. 酶解断裂染色质 1. 准备好上述交联好的细胞。如果是冻存的,需在冰上解冻。 2.加100ul含蛋白酶抑制剂的Lysis Buffer 1至细胞沉淀物中吹打混匀,涡漩离心管15s,置于冰上孵育10min;9000g离心3min,弃除上清。 3. 加0.25ul的Micrococcal Nuclease (ChIP级) (10 U/μL),涡漩离心管,在37°水浴锅温浴15min,每5min 颠倒混匀; 4. 加10μl的MNase stop 溶液终止反应,短暂涡漩混匀,冰上孵育5min。 5. 9000g离心5min,去上清,重新获得核酸复合物。 6. 用50μl的含(蛋白酶/磷酸蛋白酶)抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物,置于冰上15min,每5min涡旋15s。 7. 9000g离心5min。将酶解后含有染色质的上清液转移到一个新的1.5ml的离心管中。继续IP实验或者将样本储存在-80°。 C. 免疫沉淀蛋白-DNA复合物 1. 取5μl上述50ul酶解后含有染色质片段上清液置于1.5ml 离心管,-20°保存 2. 向剩余的45μl的上清液中加入450μl 1X IP Dilution buffer. 3. 加入一抗及500μl的稀释裂解液到Plugged spin colum。并置于摇晃平台上, 4°孵育过夜。抗体加入量如下: 阳性对照组:加10ul Anti-RNA聚合酶II抗体 阴性对照组:加1-2μl的正常的兔IgG 实验待测样本组:特异性抗体浓度为1-10μg/IP反应 4.吸取20ul的ChIP级的含琼脂糖Protein A/G均一悬液(涡旋混匀)加到每个置于摇晃平台上的IP反应管中,4°孵育1h. 孵育后,除去下面底塞,将柱子放置于2ml的收集管中。3000g 离心30s,弃去废液。 5. 塞入柱子底塞,加入0.5ml 的IP wash buffer 1 ,置于摇晃平板上,盖上盖子4°孵育5min。除去底塞,将柱子置于新的收集管中;10. 3000g离心30s。 6. 重复步骤5两次,用IP Wash Buffer 2 7. 重复步骤5一次,用IP wash buffer 3 8. 除去残留的wash buffer 将柱子置于收集管中,3000g离心1min。 (抗体的量要进行优化,防止非特异的结合;Protein-A/G回收免疫沉淀复合体;洗涤除去非特异结合的染色质) D.65℃解交联蛋白质和DNA复合物 1.重新塞滴塞,加入150μl的1X IP Elution buffer 到洗涤后的柱中,盖上盖子,恒温孵育器65°孵育30min (摇晃)。如果没有恒温摇床,则可置于65°加热板40min。每隔10min 重悬。 2. 在洗脱过程中,准备含6μl 5M Nacl和2μl 20mg/ml Proteinase K /IP 反应的 1.5ml的离心管。 3. 溶解10% total input sample 样加入150μl IP Elution buffer 、6μl 5M Nacl和2μl 20mg/ml proteinase K ,置于室温 4. 步骤1中65°温育,从加热块中移除柱子,打开盖子和底塞,将柱子置于1.5ml 含Nacl和蛋白酶K的预收集管,盖上盖子,6000g离心1min 5.弃去柱子,盖上1.5ml 离心管,漩涡所有的IP和 total-input 样本置于65°加热块中1.5h。 E. 消化蛋白,纯化富集的DNA 1 .每个IP 和total input sample,加750μl的DNA binding buffer; 2. 吸取500μl/样本到DNA Clean-Up 柱子上置于2ml 收集管中,10000g离心1min,弃去滤液; 3. 吸取残留的sample 到同样的DNA clean-up 柱子,10000g离心1min,弃去滤液; 4. 将上述柱子置于收集管中,加入750μl的DNA Column Wash buffer。10000g离心1min弃滤液; 5. 将柱子置于空的收集管中,10000g离心2min; 6. 将柱子置于新的1.5ml离心管中,吸取50μl的DNA Column Elution1. Solution 直接加入到柱子中央; 7. 10000g离心1min,弃柱子,得到的溶液为纯化的DNA,可进行实时荧光定量PCR检测

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作者:广州赛诚生物 点击:
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