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3.5 RNA pull- down实验流程

标签: 实验 RNA pull-down
摘要 : RNA pull- down实验流程
问题1:RNA 降解 可能原因:1)无核酸酶的环境被破坏 2)体外转录的RNA探针降解 解决办法:1)清洗和使用新开的离心管和试剂等 2)RNA探针合成后,电泳检测其长度和浓度
 
问题2:RNA结合蛋白的亲和力不够: 可能原因:1)结合缓冲环境没有优化 2)裂解不完全 3)磁珠用量不足 4)RNA探针用量不足 解决办法:1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件 2)增加裂解液和蛋白上样量的比例 3)增加裂解液 4)增加磁珠用量 5)增加探针用量 6)确定生物素和链霉亲和素效率
 
问题3:RNA结合蛋白没有结合 可能原因:1)靶蛋白量不足 2)缓冲体系不对 3)RNA探针和蛋白的亲和力本来就低 解决办法:1)增加上样蛋白量 2)应用低盐体系 3)加入交联试剂
 
问题4:结合的非特异性高 可能原因:1)缓冲环境没有优化 2)缓冲环境严谨性低 3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化 解决方法:1)优化孵育时间温度盐浓度等条件 2)使用严谨性高的缓冲体系 3)调低RNA探针和样品的比例 4)提高裂解液的量
 
问题5:WB信噪比高 可能原因:1)阳性信号率低 2)一抗效率低 3)蛋白没有充分溶解 解决方法:1)增加二抗的量 2)用敏感度的化学发光液 3)用细胞裂解液预孵一抗 4)增加样品的量 5)确定有没有其他可能的结合情况 6)增加裂解液用量

本文来源于广州赛诚生物科技有限公司,相应专题页面链接:http://www.gzscbio.com/news/2015/0107/8.html


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作者:广州赛诚生物 点击:
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