当前位置:生物帮 > 实验技巧 > 核酸技术 > 正文

3.6 RNA pull- down实验常见问题

标签:
摘要 : RNA pull- down实验常见问题
一. 质粒转化、涂板、摇菌
1. 取JM109感受态细菌80µl,加入1.5mlEP管中,用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中,混匀。
2. 冰上静置30min。
3. 42℃热休克90-120s。
4. 迅速移至冰上静置2min。
5. 在超净台内,于上述EP管中加入50µl lb培养基(Amp-),37℃,160rpm摇床,增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm离心10min,弃大部分上清,将沉淀重悬,菌液全部加入LB平板(Amp+)上,涂布均匀,37℃倒置培养(过夜12-15h)。
7. 将37℃培养(12-16h)平板取出,于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基(Amp+)的15ml离心管中,于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。
二. 质粒中提(TIANgen,DP107-02)
1. 柱平衡:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500µl的平衡液BL,12,000rpm离心1min,尽量吸除上清。
2. 取1.5ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000rpm离心1min,尽量吸除上清。
3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。
4. 向离心管中加入250µl溶液P2,温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5. 向离心管中加入350µl溶液P3,立即温和的上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀,12,000rpm,离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。
6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中, 12,000rpm,离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
7. 向吸附柱CP3中加入500µl去蛋白液PD,12,000rpm离心,离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。
8. 向吸附柱CP3中加入600µl去蛋白液PW,12,000rpm离心,离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。
9. 将吸附柱CP3重新放回收集管中,12000rpm离心2min。
10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50µl洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12,000rpm离心2min,将质粒溶液收集到离心管中,放冰盒,测浓度。
三. 质粒线性化:
本实验使用的酶为Biolabs的重组酶KpnⅠ。
酶切后进行跑胶。
四. 琼脂糖凝胶电泳
1. 配胶。成分:琼脂糖粉、TBE、ⅠH2O,少量EB。
2. TBE与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中,摇匀,放入微波炉加热1-2min。
3. 滴加少量EB,于锥形瓶中摇匀。
4. 倒入胶板中,插入梳子,待琼脂糖凝固。
5. 小心拔掉梳子,取10µl样品加入1µl 的10×Loading Buffer缓缓加入点样孔,并在最右边的点样孔加5µlDNA maker。
6. 接通电源。
7. 电泳完毕,关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶,于紫外灯下切下目的条带。
五. 胶回收(TIANGEN,DP214-02)
1.向吸附柱CB2中加入500µl平衡液BL,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中,称取重量。
3. 向胶块中加入等倍体积溶液PC,50℃水浴放置10min左右,其间不断的上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。
4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中。
5. 向吸附柱CB2中加入600µl漂洗液PW,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中。
6. 重复操作步骤⑤。
7. 将吸附柱CB2放入收集管中,12,000rpm离心2min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底晾干。
8. 将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12,000rpm离心2min,收集DNA溶液。
六. 转录以及生物素标记:
1.取无RNA酶管,按下表操作:


1µg线性化DNA xµl
Biotin RNA Labeling mix 2µl
10×Transcription buffer 2µl
RNA Polymerase 2µl
补足RNase-free水至18µl

2. 取出孵育好的EP管,加入2µl的DNaseⅠ,37℃孵育15min以除去体系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管,加入2µl0.2M EDTA(pH=8.0)终止反应。
4. 取1µg Biotin标记的RNA,加入适量Structure Buffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min,冰浴3min,室温静置30min。
5. 磁珠准备:使用RIP Wash Buffer 500µl冲洗磁珠3次。
6. 用50µl RIP Wash Buffer重悬磁珠,然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中,4℃过夜。
7. 过夜的混合物3000rpm离心1min,去上清。
8. RIP Wash Buffer冲洗3次,切记将液体沿壁加入或者滴加,上下缓慢翻转混匀,切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液,裂解液中加入适量RNase抑制剂,室温放置1h。
10. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心,上清回收,使用RIP Wash Buffer冲洗3次,1次1ml。
11. 于样品中加5×SDS上样缓冲液,95℃变性10min,跑SDS-PAGE凝胶。
12. 考染:取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中,摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h,中间更换几次脱色液至条带清晰,背景低为止。
13. 将目的条带切下送测序 (质谱检测)。

本文来源于广州赛诚生物科技有限公司,相应专题页面链接:http://www.gzscbio.com/news/2015/0107/7.html


详情请咨询:广州赛诚生物

作者:广州赛诚生物 点击:
    热门文章TOP
    优发国际