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3.8 荧光素酶检测技术(Luciferase )实验常见问题

标签: Luciferase
摘要 : 荧光素酶检测技术(Luciferase )实验常见问题
荧光素酶报告基因检测法是转录调控研究中十分重要的实验手段。但其结果往往存在一定的误差。为解决这一问题,现普遍采用双荧光素酶报告基因检测法。在双荧光素酶报告基因测试中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而对照报告基因作为内对照,以使实验报告基因测试的结果归一化。作归一化可消除实验过程中减弱实验准确度的变化,如培养细胞的数量、细胞转染及裂解的效率等。在研究转录调控启动子活性中,具体实验步骤如下。 1 质粒转染细胞 1.1 细胞铺板:将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。 1.2 转染:16h后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA,每个样品设置6个复孔 (1)配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为pLenti:Firefly:Renilla:转染试剂=0.2μg:0.1μg:0.01μg:0.25μL (2)稀释好DNA及转染试剂,常温孵育5min (3)将稀释好的DNA分别和转染试剂混匀,常温孵育20min (4)每孔弃去15μL培养基,将15μL DNA转染混合液添加到每孔细胞样品中 (5)转染6h后,换新鲜完全培养基 2 双报告基因检测 (1)质粒共转染48h后,弃去培养基,用100μL 1XPBS洗1遍 (2)倾斜96孔板,吸干剩余的PBS (3)去离子水将5XPLB稀释成1XPLB,使用前放到常温 (4)每孔加50μL稀释好的1X PLB,摇床常温条件下摇15min,进行裂解 (5)白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL,加入100μL预先混好的LAR II,2s后测数据 (6)每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent,静止2s后,测数据

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