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3.9 凝胶迁移电泳迁移率实验(EMSA)实验流程

标签: EMSA
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摘要 : 凝胶迁移电泳迁移率实验(EMSA)实验流程:一,探针的标记;二,探针的纯化;三,EMSA 胶的配制;四,EMSA结合反应;五,电泳分析
探针的标记 1 如下设置探针标记的反应体系: (1)待标记探针(1.75 pmol/微升):2微升。 (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X):1微升。 (3)Nuclease-Free Water:5微升。 (4)[γ-32P]atp(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml):1微升。 (5)T4 Polynucleotide Kinase(5-10 u/微升):1微升。 (6)总体积10微升。 (7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。 2 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。 3 加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。 4 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。 5 标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 二 探针的纯化 通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作: 1 对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀。 2 在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。 3 在4℃,12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。 4 在4℃,12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。 5 加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。 三 EMSA 胶的配制 1 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。 2 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。 (1)TBE buffer(10X):1毫升。 重蒸水 16.2毫升。 (2)39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v):2毫升。 (3)80甘油:625微升。 (4)10% 过硫酸铵(ammonium persulfate):150微升。 (5)TEMED:10微升。 按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。 四 EMSA结合反应 1. 如下设置EMSA结合反应。 1.1 阴性对照反应: (1)Nuclease-Free Water :7微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X):2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:0微升。 (4)标记好的探针:1微升。 (5)总体积:10微升。 1.2 样品反应: (1)Nuclease-Free Water :5微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X):2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。 (4)标记好的探针:1微升。 (5)总体积:10微升。 1.3 探针冷竞争反应: (1)Nuclease-Free Water :4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X):2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。 (4)未标记的探针:1微升。 (5)标记好的探针:1微升。 (6)总体积:10微升。 1.4 突变探针的冷竞争反应: (1)Nuclease-Free Water :4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X):2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。 (4)未标记的突变探针:1微升。 (5)标记好的探针:1微升。 (6)体积:10微升。 1.5 Super-shift反应: (1)Nuclease-Free Water:4微升。 (2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X):2微升。 (3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。 (4)目的蛋白特异抗体:1微升。 (5)标记好的探针:1微升。 (6)总体积 :10微升。 2 按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。 3 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。 五 电泳分析 1 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。 2 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。 3 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。 4 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。 5 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。

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