当前位置:生物帮 > 期刊文章 > 期刊盘点 > 正文

BioTechniques:2014最受欢迎的蛋白质分析文

标签: 蛋白质 分析
摘要 : 蛋白质的功能研究涉及了许多方法,不过这类研究的第一步往往是表达目标蛋白。日前,《BioTechniques》杂志的编辑们挑选了今年最受欢迎的五篇蛋白质分析文章,其中有三篇提出了改善蛋白质表达的实用方法。
BioTechniques:2014最受欢迎的蛋白质分析文 蛋白质的功能研究涉及了许多方法,不过这类研究的第一步往往是表达目标蛋白。日前,《BioTechniques》杂志的编辑们挑选了今年最受欢迎的五篇蛋白质分析文章,其中有三篇提出了改善蛋白质表达的实用方法。 1. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage 无细胞蛋白质合成(CFPS)系统,是快速获得大量目标蛋白的一种简单途径。与体内蛋白表达系统相比,CFPS更适合于高通量应用。CFPS系统通常是细胞抽提物的水溶液,一般通过冷冻储存,而这会占据大量的冷藏空间。冻干CFPS系统能够显著减少体积,解决它的冷藏问题。Bradley Bundy团队今年四月发表文章,详细描述了冻干CFPS系统的各个步骤。这篇文章提出了一个简单直观的方案,用于冻干源自E. coli细胞提取物的CFPS系统。文章指出,冻干CFPS系统不仅能大大减少冷藏空间,而且冻干的提取物在室温下更加稳定,运输起来更为简单。研究者们只需要给冻干粉加入水就可以获得蛋白合成系统。 2. A technique to increase protein yield in a rabbit reticulocyte lysate translation system 在表达哺乳动物蛋白的时候,人们往往更倾向于使用哺乳动物无细胞系统,比如兔网织红细胞裂解物(RRL)。这些系统能够生成翻译后修饰,而这种修饰是蛋白正常功能所必需的。不过RRL的主要问题在于,这个系统的蛋白产量比较低。添加提高翻译产量的蛋白因子,是解决这个问题的一种途径。 病毒在感染过程中会用蛋白因子上调宿主细胞的翻译活性。Denis Kainov等人发现,这种因子很适合用来提高RRL的产量。他们选用了甲型流感病毒的NS1蛋白,这种蛋白能阻止宿主的翻译机器关闭。研究人员将脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)添加到目标mRNA上,然后向RRL系统中加入重组NS1,结果使蛋白产量提高了十倍。如此显著的改善受到了RRL使用者们的一致欢迎。 3. Off-on polyadenylation strategy as a supplemental mechanism for silencing toxic transgene expression during lentiviral vector production 这篇文章描述了一个在哺乳动物细胞中有效抑制转基因表达的方法。表达毒性转基因的慢病毒载体可以用于基因治疗,虽然起治疗作用的转基因需要在目标细胞中表达,但在载体生产过程中抑制转基因表达是很有必要的。293T细胞是常用的慢病毒载体生产细胞,转基因的表达会显著降低293T细胞的产量,因此必须被尽可能的沉默。 常用方法是使用组织特异性启动子,这种启动子只在目标细胞有活性,在载体生产细胞中没有活性。然而,这种方法并不总是那么有效。Bagnis等人为我们提供了另一种选择,他们六月份发表的文章描述了一个新慢病毒载体,能够在生产载体的293T细胞中强力沉默转基因。研究人员精心布置了病毒控制元件的定位和方向,并构建了缺乏多聚腺苷酸化信号的转基因,以便达到强效沉默的效果。这种载体转染目标细胞之后,逆转录会使病毒控制元件重排,转基因只需要一个多聚腺苷酸化信号就可以表达。这一技术将成为在慢病毒载体生产细胞中抑制毒性转基因表达的有力工具。 4. Resolving acetylated and phosphorylated proteins by neutral urea Triton-polyacrylamide gel electrophoresis: NUT-PAGE 理解磷酸化、乙酰化等翻译后修饰在蛋白功能调控中起到的作用,是研究真核蛋白的一个关键问题。这些修饰会改变蛋白所带的电荷,可以通过等电聚焦(IEF)等电荷依赖性凝胶电泳进行分析。然而,在许多情况下IEF需要SDS-PAGE的补充,以分辨电荷类似但质量不同的蛋白,这无疑增加了实验的繁琐性也提高了实验成本。TAU(Triton acetic acid urea) PAGE是一种基于尿素的凝胶电泳,能够使蛋白变性并维持蛋白所带的电荷,这样的方法可以同时依据质量和电荷将蛋白分离。这个方法的问题在于,TAU-PAGE的酸性不能很好的分析一些磷酸化蛋白。Buehl等人八月份发表的文章,描述了一种中性pH的尿素凝胶系统。他们开发的NUT(neutral urea Triton)-PAGE很简单也很便宜,可以很好的分析酸性和碱性蛋白的磷酸化和乙酰化形式。NUT-PAGE有望成为IEF、2-D PAGE之外的另一种选择。 5. Investigation of membrane protein–protein interactions using correlative FRET-PLA 研究蛋白质功能很多时候意味着要了解它们与其他蛋白的互作。分裂泛素系统(split ubiquitin system)等体外分析法可以初步鉴定膜蛋白之间的互作。不过免疫共沉淀这样的标准方法并不适合对膜蛋白互作进行验证,因为膜蛋白离开细胞膜之后一般不能正常互作。 膜蛋白互作最好是在体内实验中进行研究,让这些蛋白始终处于细胞膜中。可选择的分析方法主要有FRET(荧光共振能量转移)和PLA(邻位连接)。Ivanusic等人十月份发表的文章,向人们展示了这两种方法结合而成的FRET-PLA技术。他们将两个interactor分别融合在黄色荧光蛋白(YFP)和青色荧光蛋白(CFP)上,然后给蛋白标记上不同的多肽,作为PLA时抗体结合的目标。这一技术大大提高了定位膜蛋白互作的灵敏度和空间分辨率,能够分辨纳米级的邻近程度。 作者:浮游 点击:
    热门文章TOP
    优发国际