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斑马鱼的内参基因组怎么选择啊

摘要 : 最近我做了荧光定量PCR,每次做的时候溶解曲线效果就很差,不是单一的峰,说明是有非特异性的扩增,但是在普通PCR仪上做的PCR时,只显示了一条带,很清晰,是怎么回事啊?荧光定量的灵敏
最近我做了荧光定量PCR,每次做的时候溶解曲线效果就很差,不是单一的峰,说明是有非特异性的扩增,但是在普通PCR仪上做的PCR时,只显示了一条带,很清晰,是怎么回事啊?荧光定量的灵敏度太大了么?还有斑马鱼的内参基因怎么选取?做的是相对定量。 答:你说对了,荧光定量的灵敏度太大了。你要明白件事情,EB染色的情况下,在电泳上要形成一个条带的前提是存在5ng的DNA,也就是,如果你的非特异性扩增产物低于5ng的话,你在电泳上是观察不到的,但是SYBR Green染色的情况下,定量pcr可以检测到。 你具体PCR的条件我不是很清楚,但是你可以考虑通过以下几个方面来优化,一个是延长解链时间,保证DNA的充分解链,延长扩增时间,保证扩增的完整性,提高退火温度,减少引物和模板的非特异性结合。此外,你的RNA在反转录前用DNase处理,减少基因组的污染,也有助于提高扩增的特异性。 你如果检测相对表达,最理想的状态,干脆用特异性引物来反转录,事实上,虽然很多人做相对定量都习惯于用随机引物或者是ologo dT来反转录,但是从结果上讲,使用特异引物做反转录最后拿到的结果要更可靠,也更具有特异性。只是反转录的试剂消耗要加倍的,同一个样品你必须单独反转录内参基因和目的基因。如果你要检测其他目的基因,相应消耗更多。 至于内参基因,一般动物细胞的那几个内参基因,Acin,Tubulin, RPL32之类的,最好你能预先检测一下,挑一个最稳定的出来。不要随便用,没有全部通用的内参基因的。 作者:周慕云 点击:
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