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cRNA探针在原位杂交组织化学(ISHH)中的应用

摘要 : 组织准备:大鼠以10%水合氯醛(0.3ml/100g 体重),或1%戊巴比妥钠约1ml(3~4mg/100g体重)腹腔内注射麻醉,用100ml生理盐水冲洗和150ml 4%多聚甲醛主动脉灌注固定。固定半小时后,取出组织块,置入4%多聚甲醛液中后固定4~6h,4℃。
一、同位素标记cRNA探针在ISHH中的应用 (一)组织切片的原位杂交细胞化学方法 (1)组织准备:大鼠以10%水合氯醛(0.3ml/100g 体重),或1%戊巴比妥钠约1ml(3~4mg/100g体重)腹腔内注射麻醉,用100ml生理盐水冲洗和150ml 4%多聚甲醛主动脉灌注固定。固定半小时后,取出组织块,置入4%多聚甲醛液中后固定4~6h,4℃。 如要取脑组织,可于灌注后置4℃冰箱内过夜,次晨取脑组织,后固定4℃4h左右。 (2)组织切片/培养细胞在经过处理,抹以粘附剂的载片上,在43℃烤箱过夜。 (3)在PBS(0.1mol/l Ph7.2)中浸5~10min。 (4)浸于0.1mol/L甘氨酸—PBs 液内5min。 (5)为增强组织通透性,将载片置于0.3%Triton X-100(在PBS内)10~15min。 (6)PBS洗3×5min。 (7)在蛋白激酶K(1μg/ml)溶于Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA(50mmol/L,pH8)中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液,不加EDTA的。 (8)浸入新鲜配制的4%多聚甲醛(在PBS0.1mokl/L,pH7.2)3min以终止消化作用和再固定。 (9)浸入新鲜配制的含0.25%(V/V)三乙醇胺(0.1mol/l pH8.0)中,10min以达乙酰化(Acetylate)的目的。 (10)预杂交:在50%(V/V)甲酰胺溶于4×SSC预热37℃15~45min 。 (11)杂交:将载片上过量的甲酰胺液倾去,加20μl杂交混合液(含放射性同位素标记的探针量为5×103~106cpm/每张载片)。覆以硅化的盖玻片,置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒内以保持湿度,42℃孵育12~18h。为使载片不致于浸泡于SSC溶液内,通常以二根玻管(或棒)扎成担架状,载片置于玻棒上,与盐液不接触,但可保持盒内空气湿润。 (12)杂交后漂洗 ①以小烧杯盛适量4×SSC溶液,将载片一端斜插入溶液内,轻轻抖动以移除盖玻片。 ②将载片置于有刻度的染色用小方玻缸内,加入42℃(预热)4×SSC,3×20min。在漂洗过程中宜不断振动,以增强漂洗效果。如设有调整钮的振动台更为理想。 ③加20μlRNA酶溶液(20μg/ml)在NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和EDTA(1mmol/L,pH8.0)消化未杂交探针,42℃30min(也有不加EDTA的)。 ④以递减梯度盐溶液SSC漂洗载片:2×SSC,0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。 ⑤梯度酒精脱水:70%,90%,2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺,室温,每次10min,空气干燥后待进行放射自显影。 (13)放射自显影和复染 ①在暗室中预热水浴至45℃,将分装的核乳胶溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h,同时预热一电热板至45℃。将杂交后漂洗过完全干燥的载片依次排列于玻片架上,有组织切片一面面向实验者。在实验的载玻片前放1~2张无切片的干净玻片,作为测定核乳胶溶解度与浸片高度等的空白对照片。浸泡(Dipping)过核乳胶膜的载片放入暗盒内,事先最好将暗盒准备好,为保持干燥,放入一包变色硅胶干燥剂(无水干燥剂为小块蓝色晶体,吸水后呈粉红色,置烤箱中烘干待转成蓝色后可重复应用),预先备好封固暗盒用的胶带备用。 ②核乳胶液,国外产品为ILFord K5乳胶液,国内核乳胶产品可自原子能研究所订购。不论国产或进口乳胶,事先应(按说明需要浓度)稀释分装在10ml小瓶内,密封于暗盒内,4℃备用。反复的冷冻和融解核乳胶会增加背景染色。每一小瓶供一次性实验应用。 为节 省核乳胶,切片宜贴附在靠近载片的一端。这样,在浸泡时少量乳胶便可充分覆盖切片。 ③浸核乳胶(Dipping):当一切准备工作就绪后,在暗室中(只留完全灯)先将载片置于电热板上预热1~2min。以空白载片浸入核乳胶液,取出后检查核乳胶是否充分溶解,玻片上有无气泡。然后正式进行切片浸入。浸核乳胶膜是一项需反复操练的技术。以拇、食指夹住玻片一端,以垂直方向进入乳胶,进入的提出均应采取中速度,且速度应保持稳定,提出后可将玻片一端滴下的乳胶轻沾于吸水纸上,掌握好该技术,浸入形成的核乳胶膜厚度适当,均匀一致。依序放在预热45℃的电热板,倾斜度应一致。在45℃电热板上干燥至少1~2h,在此期间应严格控制在黑暗中。 ④装入暗盒曝光:将载片架上已干燥覆有核乳胶的载片放入暗盒内,周围用胶带封固,以标签写明:样品种类,实验者姓名,曝光日期等放在4℃冷房或冰箱内。曝光时间依同位素种类而异,32P大约需5~7日,3H需4周,但还要参考细胞内mRNA的含量而定,含量高者曝光时间宜短,反之宜适当延长。可根据不同曝光时间的实验结果予以调整。曝光时间长可增加信号,但也增加背景,反之,信号减弱,但背景亦低。 ⑤显影:取出切片中暗盒(注意:切勿启封),放在室温至少1h,使其回升到室温。然后在暗室内(只留安全灯),将载片置入Kodax D19显影液(预调温至18~20℃)3min。水冲片刻后入Kodax F24固定剂内3min。上述溶液及水温最好都保持在18~20℃。突然改变溶液温度会损坏精细的核乳胶膜。另外,在显影和定影过程中不要振荡溶液,因为,这时的乳胶还是处于胶状结构,溶液振荡的冲击可使乳胶膜产生划痕。 ⑥冲洗,脱水和复染:用自来水(水冲力勿过猛)冲洗载片20min,如需要可用1%苏木精复染,复染后自来水冲洗分化2min,梯度酒精脱水(70%,90%,100%)每次3min,二甲苯透明,DPX封片。 (二)培养细胞的原位杂交细胞化学方法 (1)固定:通常将细胞培养在盖玻片或塑料薄膜上,可将盖玻片取出,倾去培养液,用4%多聚甲醛液固定2~4h后,依组织切片处理法进行ISHH实验。也有在4%多聚甲醛室温固定20min后,由低浓度30%,50%,70%酒精各3min ,保留在新鲜配制的70%酒精中,4℃,备用。 (2)重回到水:50%,30%酒精3min,无菌重蒸水2×3min,然后置入PBS含5mmol/l MgCl2 10min,室温(配制法:200ml PBS, 1ml MgCl2)。 (3)0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4:室温10min(0.1mol/L 甘氨酸,0.2mol/l Tris(配制法:1.5mg甘氨酸和20ml Tris,应用重蒸水制成200ml)。 以后步骤同(一)组织切片法。 二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用 (一)光敏生物素标记cRNA探针的应用 以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针,使其最终浓度为0.5~1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素(1μg/μl)混合。在150瓦卤素灯下,距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素,再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针,将其溶于适量的灭菌双蒸水,用紫外分光光度计测探针的光密度(详第十九章 ),其最佳工作浓度为2μg/ml。 切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节 。 光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序: (1)石蜡切片脱蜡入水后,置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min;冰冻切片直接入PBS冲洗5min。 (2)0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。 (3)0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。 (4)蛋白酶K1μg/ml(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保温30min。 (5)4%多聚甲醛PBS固定5min。 (6)0.1mol/l PBS冲洗2×3min。 (7)0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。 (8)2×SSC冲洗10min(1×SSC:0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠)。 (9)取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上,如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min,马上放入冰浴中冷却,然后再用。 (10)盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜,入温盒43℃保温12~16h。 (11)4×SSC洗脱盖片,并在同一液中37℃漂洗10~30min。 (12)2×SSC(含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针)冲洗30min,37℃。 (13)1×SSC,0.1×SSC,37℃各漂洗10~30min。 (14)0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。 (15)3%BSA(0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保温30min。 (16)Avidin –AKP(碱性磷酸酶)(1:500~1:100,0.4%Triton X-100 PBS配)室温1~3h。 (17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。 (18)TSM1冲洗2×5min。 (19)TSM2冲洗2×5min。 (20)硝基四氮唑蓝(NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)0.2mg/ml混合液显色,室温,暗处3h。 (21)20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。 (22)甘油明胶直接封片。 结果:杂交阳性部位着蓝黑色。 组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒,实验者需戴手套。 (二)酶促生物素标记cRNA探针的应用 基本方法和放射性标记cRNA探针同,所不同的是探针浓度为2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。 (1)用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。 (2)将载片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。 (3)PBS冲洗2×3min,用吸水纸拭干切片周围的水份,加入小鼠抗生物素血清1:100和PBS含正常羊血清(1:30),室温1h,或4℃过夜。 (4)PBS彻底冲洗。 (5)载片加生物素化抗小鼠IgG(1:100)30min室温。 (6)PBS彻底冲洗。 (7)应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h,室温。 (8)PBS彻底冲洗。 (9)将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液,0.02%H2O2,孵育3~15min。 (10)水洗,复染,脱水,透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染,多层ABC或PAP法加强染色效果。 三、地高辛标记cRNA探针的应用 (一)基本原理 地高辛(Digoxigenin 简写Digo-)又称异羟基洋地黄毒甙配基,这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物,其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应,地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成digoxigenin –11-dUTP(图20-3)。通过随机引物或缺口翻译法(多用随机引物法),将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连,构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交,然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab(抗原结合片段)结合物作为酶标或荧光标记,再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的,其反应过程见图20-3。 常用的免疫酶学检测方法有两类:一是Dig –HRP(辣根过氧化物酶)检测体系,以DAB(四氢氯化二氨基联苯胺)/H2O2为底物,结果为棕色;或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物,结果为蓝色。另一是Dig –AKP检测体系:以BCIP/NBT为底物,结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似,如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应,AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右,但HRP的优点为价廉、稳定。 应用地高辛标记的核酸探针也较稳定,据报告在-20℃贮存可达2年,随时要取用,不像放射性标记探针有半衰期所致的时间限制。但在现实应用中,仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记3~6个月以内的核酸探针。为节 省核酸探针的用量,凡使用过的含有探针的杂交液也可反复多次使用,特别是对于已知的重复性实验。对于细胞或组织内未知mRNA的检测,仍宜采用未使用过的探针杂交液为佳。 与放射性标记相比,地高辛标记探针具有非放射性探针的优点,对人体无害,不受半衰期限制,探针可长期保存。与生物素标记探针相比,地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰,敏感性高。由于地高辛具有灵敏度及分辨率高,反应产物颜色鲜艳,反差好,背景染色低,制备探针可较长期保存,对人体无害等优点,已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。它不仅可应用于原位杂交细胞化学,还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序列,进行RFLP分析用于基因诊断,菌落原位杂交,噬菌斑原位杂交,固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中,组织中病毒DNA序列的检测。这一技术还被应用于检测DNA标记物及测序,对人类染色体连锁图谱进行构建和基因图谱分析。 (二)基本操作步骤 组织处理及预杂交等步骤与本章 中叙述的放射性同位素标记cRNA探针相同,但由于地高辛标记cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用,我们在基本方法中仍较详细的叙述其操作过程。 1.组织前处理在组织制片中以冷冻切片(厚10~30μm)最佳。切片贴在预先清洁,高温处理并涂以粘附剂载玻片上,先在37℃预干燥4h,然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2~3周,在-70℃可保存数月之久,有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片,应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜,然后进行杂交前处理。 在烘烤及低温保存时,为防尘埃及空气中RNA酶的污染,宜用锡箔纸(foilpaper)包被,内加少许干燥剂(变色硅胶)。 下列步骤所需玻璃器皿均需消毒,操作者需戴手套。 (1)PBS洗2×3min。 (2)选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。 其它切片暂放于PBs 内。 RNA酶对照片处理方法:加RNA酶(100μg/ml)在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液,在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗,2×3min,然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。 (3)蛋白酶K消化:将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0,内含蛋白酶K1μg/ml,孵育15~20min。消化时间应根据组织的种类,厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入,过长影响细胞或组织的形态结构。 (4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。 (5)在4%多聚甲醛/PBS3min。 (6)以PBs 漂洗2×3min。 (7)浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min,以封闭非特异性结合部位。 (8)2×SSC漂洗15min。 2.杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液,按每张切片10~2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml,用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜,置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃,16~18h或过夜。 3.显示 (1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。 (2)在缓冲液1中10min,室温以封闭非特异性结合部位。 (3)拭干切片周围的载片,注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1:500,以缓冲液1稀释),孵育2h,室温。 (4)缓冲液1漂洗3×3min。 (5)浸入缓冲液210min室温。 (6)浸入底物中孵育10~30min(或更长时间,视需要而定),底物内含显色BCIP/NBT,室温。最好用锡箔纸包裹反应盒,使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。 (7)将切片浸入缓冲液3以终止反应。 (8)复染,可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁丫)(pyronin 丫)10~30s。 (9)流水洗5~10min,直至水无色为止。 (10)在切片未干前,以PBS/甘油封固切片,如要永久保存,可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份,在封固前可进行梯度酒精脱水,透明,DPX封固,但每步时间仅需几秒钟,时间过长易致褪色。 几点说明 ①缓冲液1,2,3配制法见附录。缓冲液1中BSA用量大,价贵,如无法负担可略去。 ②切片处理过程可采取漂浮法或载片染色法,载片染色适用于切片数数量较少时,可用液体覆盖于切片表面进行孵育,漂洗在烧杯内进行。如切片多,可将载片置于方形的染色缸(staining jar)内,将冲洗液加入缸内,如有振荡器在漂洗中稍加震荡更有助于减低背景染色。漂浮法适用于切片数量大量,将切片置于凹形碟内,或染色缸内。漂浮法的优点是节 约试剂用量,切片两面均可接触反应液,有利于信号的增强。 ③在底物中孵育时间过长会产生弱强的非特异性染色,有时甚至误为阳性反应。解决方法一是设置对照片,二是对非特异性染色加以区别。非特异性染色与特异性染色的主要区别点在于后者有结构性定位,而前者系无结构性定位,常在切片边缘或细胞密集处呈现较强的颜色反应。 ④在组织前处理中应严格注意控制RNA酶的污染,包括戴手套、器皿消毒等。另外,和免疫细胞化学一样,自始至终应保持切片的湿润,勿令其干燥。 作者:网友 点击:
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