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几种常见RNA探针及其特点

摘要 : RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种:即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。
几种常见RNA探针及其特点: RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种:即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。 1. cRNA探针:是以cDNA为模板,通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针,因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理,以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点,cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍,因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是:探针的制备过程比较复杂,需要较好的分子生物学实验设备,它对RNA酶敏感,易受破坏,操作中要谨防RNA酶污染。

2. 单链cDNA探针:由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列,又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点,从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难,在RNA原位杂交中已很少见有应用。
3. 寡核苷酸探针:人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料,通过DNA合成仪合成,避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短,不需要纯化,组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针,特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是:探针长度必须适宜,探针太长可造成内部错误配对杂交,探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定,再则探针较短,所携带的标记物少,敏感性较低。 有人认为主要是要注意几个方面:首先多用寡核苷酸探针,不主张用太长的cDNA探针,因为前者穿透力强,能轻易找到目标,确实存在特意性和结合率地于cDNA探针,但一般也有弥补的方法,就是同时加入多根寡核苷酸酸探针,这样阳性率就高多了;其次,设计探针的时候尽量要遵循探针设计的原则,如不要同时有三个以上连续的碱基序列,GC含量不要太高等等;最后探针设计的位置很重要,为了避免检测mRNA时基因组序列的干扰,设计探针时尽量选择在跨内含子的部位,就是能检测到mRNA,但检测不到基因组序列.只要把你的mRNA和基因组DNA一比对,就能选择到合适的部位. 检验地带网 依标记物不同,探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3H 、35C、32P和125I等,不同的同位素探针其穿透力,定位和半衰期各不相同,无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短,性能不稳定,污染环境和危害健康等原因,在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少,而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展,其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针,不但探针的具有生物素标记优点,还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点,其应用越来越广泛。 作者:网友 点击:
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