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3.1 miRNA的一般研究策略

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摘要 : miRNA也称微RNA、microRNA,是真核生物中广泛存在的一种长度为21-23nt的RNA分子,可通过与mRNA的结合,抑制mRNA的转录,因此在基因表达调控、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。 图1 miRNA的一般研究策略及相关实验手段 1 生物信息学预测靶基因 要对miRNA进行研究,首先需要采用生物信息学的方法预测miRNA的靶基因位点,即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。 2 靶基因的预测结果确认 进行靶位点预测之后,接着是要通过miRNA pulldown方法,识别靶基因位点。其中,有以下三种常用的pull-down方法: (1)生物素化的miRNA pull-down(biotinylated miRNA pull-down)。通过生物素标记的合成miRNA转染细胞,孵育后裂解细胞,用链霉亲和素包被磁珠吸附筛选miRNA及其作用的mRNA。 图2 生物素化的m
miRNA也称微RNA、micrornA,是真核生物中广泛存在的一种长度为21-23nt的RNA分子,可通过与mRNA的结合,抑制mRNA的转录,因此在基因表达调控、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。 3.1 miRNA的一般研究策略 图1 miRNA的一般研究策略及相关实验手段 1 生物信息学预测靶基因 要对miRNA进行研究,首先需要采用生物信息学的方法预测miRNA的靶基因位点,即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。 2 靶基因的预测结果确认 进行靶位点预测之后,接着是要通过miRNA pulldown方法,识别靶基因位点。其中,有以下三种常用的pull-down方法: (1)生物素化的miRNA pull-down(biotinylated miRNA pull-down)。通过生物素标记的合成miRNA转染细胞,孵育后裂解细胞,用链霉亲和素包被磁珠吸附筛选miRNA及其作用的mRNA。 3.1 miRNA的一般研究策略 图2 生物素化的miRNA pull-down (2)标记的miRNA pull-down(labeled microRNA pull-down assay,LAMP),通过用地高辛(DIG)标记的pre-miRNA寡核苷酸与细胞提取物混合孵育,用抗地高辛的抗体做免疫共沉淀(IP),获得被共沉淀的mRNA。 (3)核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量测序(Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis,RIP-Chip,RIP-seq),通过用合成的miRNA转染细胞,孵育后裂解细胞,用特异的抗AGO2抗体对RISC进行免疫共沉淀,对获得的mRNA进行microarray分析。 3.1 miRNA的一般研究策略 图3 RIP-Chip基本实验流程 3 miRNA的直接功能确认 通过实验方法验证miRNA是否能特异结合靶mRNA并特异抑制其表达。 (1)3’-UTR reporter assay 通过在报告基因如荧光素酶CDS的下游3’-UTR区域插入待确认的目的基因,克隆到载体如psiCHECK-2上,载体转染细胞,再用miRNA进行处理,如果目的基因上含有靶位点,则荧光素酶的转录受到抑制不发荧光。 3.1 miRNA的一般研究策略 图4 3’-UTR报告基因基本实验流程
3.1 miRNA的一般研究策略
图5 3’-UTR报告基因验证miRNA直接作用情况 (2)miRNA的上调与下调 通过人工合成miRNA模拟物(miRNA mimics)或miRNA抑制物(miRNA inhibitor),增强或抑制miRNA的抑制效果,并与对照相比。 3.1 miRNA的一般研究策略 图6 miRNA的上调与下调验证miRNA直接作用情况 (3)位点定向突变(site-directed mutagenesis) 首先,将待测基因反转录为cDNA,通过用致突变的引物对cDNA模板进行重叠PCR扩增;然后,用相关的酶(一般为Kinase-Ligase-DpnI)对cDNA模板进行消化,克隆到报告基因载体;最后,将构建好的克隆转染至细胞,检测报告基因的表达。若表达显著下降,可表明靶位点定位准确。 3.1 miRNA的一般研究策略 图7位点定向突变基本实验流程 4 miRNA的整体功能验证 对miRNA的上调/下调,通过Western Blot或其他生物学通路分析实验,探究miRNA最终是如何影响细胞、疾病等等情况。 5 miRNA的定量和定位 通过RT-qPCR、原位杂交(in situ hybridization)、microarray等实验手段,确定miRNA的具体表达量及其所在位置,以明确补充其机理研究。

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