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3.2 AGO2在miRNA研究中的应用

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摘要 : AGO蛋白在miRNA通路中发挥多种功能。它们通过产生ac-pre-miRNA,参与了miRNA装配的过程,同时它们是RISC效应器蛋白,介导mRNA降解、去稳定作用或者转录抑制。另外,AGO2蛋白可以在转录后调控调节miRNA丰度,内源性Ago2的减少会降低成熟miRNA的表达和活性。Ago2的这个特殊功能是独立于它的剪切功能及内切酶活性的。 1 人类AGO2蛋白 图1 人源AGO2基因染色体及cDNA结构图 尽管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi结构域,但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明,人体内4中AGO蛋白(EIF2C1/hAGO1,EIF2C2/hAGO2,EIF2C3/hAGO3,EIF2C4/hAGO4)中,只有EIF2C2/hAGO2具有剪切活性。进一步研究显示,RNase H酶的活性位点包括一个天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸肽链(Asp-Asp-Glu/Asp motif),正是这段肽链与Mg2+结合。人体AGO1及AGO4蛋白中的肽链都和这段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸肽链不同,而AGO3虽然拥有相同的保守肽链,在体外实验中同
AGO蛋白在miRNA通路中发挥多种功能。它们通过产生ac-pre-miRNA,参与了miRNA装配的过程,同时它们是RISC效应器蛋白,介导mRNA降解、去稳定作用或者转录抑制。另外,AGO2蛋白可以在转录后调控调节miRNA丰度,内源性Ago2的减少会降低成熟miRNA的表达和活性。Ago2的这个特殊功能是独立于它的剪切功能及内切酶活性的。 1 人类AGO2蛋白 3.2 AGO2在miRNA研究中的应用 图1 人源AGO2基因染色体及cDNA结构图 尽管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi结构域,但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明,人体内4中AGO蛋白(EIF2C1/hAGO1,EIF2C2/hAGO2,EIF2C3/hAGO3,EIF2C4/hAGO4)中,只有EIF2C2/hAGO2具有剪切活性。进一步研究显示,RNase H酶的活性位点包括一个天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸肽链(Asp-Asp-Glu/Asp motif),正是这段肽链与Mg2+结合。人体AGO1及AGO4蛋白中的肽链都和这段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸肽链不同,而AGO3虽然拥有相同的保守肽链,在体外实验中同样未表现出剪切活性。体外实验中,通过突变改变人体AGO2这段保守序列后,AGO2失去剪切活性。 表1 基因沉默中可能与AGO2相互作用的蛋白
3.2 AGO2在miRNA研究中的应用
为得到AGO2蛋白具有剪切功能的直接证据,Meister构建了EGFP标记的报告基因。将此报告基因转染Hela细胞,筛选得到稳定表达的细胞株。向此细胞株中转染与报告基因的3’-UTR互不配对的全长miR16。一段时间培养后,实验组(转染miR16)Hela细胞表达的绿色荧光明显减弱,对照组(未转染miR16)荧光无明显变化,证实EGFP标记的此报告基因可被miR16抑制表达。选取实验组细胞,分别敲除AGO1-4。与未敲除细胞相比,敲除AGO1/ AGO3/ AGO4组细胞荧光表达无明显变化;敲除AGO2组细胞荧光表达明显上调。证实在miRNA介导的对靶mRNA的降解过程中,只有AGO2具有剪切活性,能够剪切mRNA。 2 AGO2影响miRNA作用的发挥 (1)AGO2参与miRNA装配过程 在细胞核中,RNA合成酶II或III产生Pri-miRNA转录本,接着Drosha-DGCR8复合物对pri-miRNA进行剪切,获得的前体发夹结构,pre-miRNA,被Exportin-5-Ran-GTP从细胞核转移到细胞质。RNA酶Dicer与双链RNA结合蛋白TRBP的复合物剪切pre-miRNA 为它的成熟长度。成熟miRNA的功能链被Ago2装配到RNA介导沉默复合物RISC上,它引导RISC,通过mRNA剪切、转录抑制或脱腺苷化对靶mRNA进行沉默,而信使链则被分解。 3.2 AGO2在miRNA研究中的应用 图2 miRNA生产过程的“线性化”经典途径 (2)AGO2的修饰调节AGO2的活性机制 在细胞应激条件下,人AGO2蛋白可以在Ser387残基被p38 MAP激酶磷酸化有助于AGO2定位到处理器processing bodies上。P-bodies是非转录mRNA和与mRNA翻转、转录抑制相关的多种酶系的累积场所,包括AGO2蛋白和miRNAs。 3.2 AGO2在miRNA研究中的应用 图3 miRNA生产过程因子的调控 (3)RISC装配复合物(RLC):Dicer、TRBP和PACT与AGO2的连接 RISC是miRNA通路的细胞质效应器,包括一个单链miRNA将它引导至其靶mRNA。细胞质miRNA的处理和RISC的装配都是被RLC所介导。RLC是一个多蛋白复合物,包括RNase Dicer、双链RNA结合蛋白复合物TRBP(Tar RNA binding protein)和PKR的蛋白激活物PACT,其核心组分为AGO2,介导RISC作用于mRNA靶位点。 Dicer和TRBP相互作用,而后被Ago2招募,形成三体复合物,结合被转运的pre-miRNA组成RISC装配复合物RLC。 3.2 AGO2在miRNA研究中的应用 图4 Dicer、TRBP与AGO2的连接 (4)AGO2介导pre-miRNA的剪切:ac-pre-miRNA 由于miRNA的发夹茎环结构上序列互补程度非常高,在Dicer介导的序列剪切之前需要一个额外的内切核苷酸的剪切步骤:AGO2的剪切功能被激活,剪切发夹结构的3’ 臂——预期为信使链的中间,得到一个带缺口的发夹架构,产生AGO2-剪切的miRNA前体或称为ac-pre-miRNA。Dicer处理这个前体和pre-miRNA的效率是一样的。 3.2 AGO2在miRNA研究中的应用 图5 AGO2介导pre-miRNA的剪切 3 AGO2的实验应用 AGO2是RISC的核心组分,联系着miRNA和它们的mRNA靶位点。因此,在合适的条件下对AGO2的免疫纯化(IP)可以获得相互结合的miRNA和mRNA,从而识别miRNA的靶位点。还可以进行免疫荧光,检测三者复合物在细胞内的定位。 3.2 AGO2在miRNA研究中的应用 图6 结合AGO2的RNA的系统分选与鉴定
 
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