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3.3 lncRNA的一般研究策略

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摘要 : 1 LncRNA的一般研究策略 图1 LncRNA的一般研究策略 (1)LncRNA筛选 通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析;通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA,构建共表达网络,预测lncRNA的靶基因;通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证,确定其表达差异。 (2)LncRNA全长克隆 可以通过5RACE获取lncRNA 5全长,3RACE获取lncRNA 3全长,最终拿到完整的lncRNA序列。 (3)表达分析 细胞水平表达:在细胞水平进行检测表达差异。 组织分布:检测不同组织、不同阶段表达特性。 表达水平动力学变化:比较不同处理条件下,如药物处理、诱导处理下,表达水平差异。 (4)功能研究 功能获得性研究:构建lncRNA过表达载体。 功能缺失性研究:可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA,干预 lncRNA后检测其对疾病相关基因表达影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响。 可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法
1 LncRNA的一般研究策略 3.3 lncRNA的一般研究策略 图1 LncRNA的一般研究策略 (1)LncRNA筛选 通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析;通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA,构建共表达网络,预测lncRNA的靶基因;通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证,确定其表达差异。 (2)LncRNA全长克隆 可以通过5'RAce获取lncRNA 5'全长,3'RACE获取lncRNA 3'全长,最终拿到完整的lncRNA序列。 (3)表达分析 细胞水平表达:在细胞水平进行检测表达差异。 组织分布:检测不同组织、不同阶段表达特性。 表达水平动力学变化:比较不同处理条件下,如药物处理、诱导处理下,表达水平差异。 (4)功能研究 功能获得性研究:构建lncRNA过表达载体 功能缺失性研究:可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA,干预 lncRNA后检测其对疾病相关基因表达影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响。 可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。 表达调控:将lncRNA表达与其他领域相结合,解释lncRNA调控机理。 转录因子:研究lncRNA与转录因子的调控机制。 染色质重塑:lncRNA表观调控。 ceRNA机制:研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之间的调控机制。 2 LncRNA的一般研究实验手段 3.3 lncRNA的一般研究策略 图2 LncRNA的一般研究实验手段 (1)与蛋白质的相互作用 识别lncRNA的蛋白质伙伴,可以为它们的功能的机制和路径提高线索。RIP技术,如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)、UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗体来pulldown核蛋白复合物,然后从中分离相关RNA用于分析。每个变体都有它各自的优势和缺陷。nRIP提供交联产物,而CLIP在避免交联产物的重新组合的同时用于识别RNA与蛋白质相互作用位点。这些技术可以结合高通量测序,如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq,来识别lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子,尽管还需要技术手段的确认。 (2)与DNA的相互作用 有几个实验技术被用于识别lncRNA的基因组靶位点。以染色体免疫共沉淀(ChIP)和RIP技术的原理为基础,使用染色体RNA免疫共沉淀(ChRIP)来识别与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面,chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)、capture hybridization of RNA targets (CHART)使用标记的互补寡核苷酸来识别与目的RNA相互作用的DNA位点。 3.3 lncRNA的一般研究策略 图3 ChIRP基本实验流程 (3)结构特征 lncRNA可以形成特殊的二级和三级结构来执行它们的功能。通过selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-line probing来获得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析,如SHAPE-Seq,连接其它依赖于RNA酶消化的技术,如fragmentation sequencing (FragSeq)和parallel analysis of RNA structure (PARS)。

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作者:广州赛诚生物 点击:
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