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4.2 RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP)实验流程

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摘要 : 一. 细胞裂解液获取 A. 单层细胞或者贴壁细胞处理 1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次 2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff管 3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min 5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80℃ B. 悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解 C. 组织样品处理 1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次 2. 加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数 3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min 5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80℃ 二. 磁珠的准备 A. 实验前准备 1、enpendoff管 2、磁力架 3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上 4、抗体,置于冰上 5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min,枪喷DEPC水 B. 磁珠准备过程 1. 重悬磁珠 2. 标记实验所需的enp
一. 细胞裂解液获取 A. 单层细胞或者贴壁细胞处理 1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次 2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff管 3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min 5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80℃ B. 悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解 C. 组织样品处理 1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次 2. 加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数 3. 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min 5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80℃ 二. 磁珠的准备 A. 实验前准备 1、enpendoff管 2、磁力架 3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上 4、抗体,置于冰上 5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min,枪喷DEPC水 B. 磁珠准备过程 1. 重悬磁珠 2. 标记实验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照 3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管 4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡 5. 将enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次 6. 用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠,加入约5ug相应抗体于每个样品中 7. 室温孵育30min 8. 将enpendoff管置于磁力架上,弃上清 9. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次 10. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上 三. RNA结合蛋白免疫沉淀 A. 准备工作 1、冰盒 2、360°旋转仪 3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上 B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程 1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer 2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer 3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,14,000rpm,4℃离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml 4. 4℃孵育3h至过夜 5. 短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清 6. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6次 四、RNA纯化 A. 实验前准备 1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min,喷DEPC水以除RNA酶 2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上 3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇 4.DEPC水置于冰上 5. 离心机预冷 6. 冰盒 B. RNA纯化过程 1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul 2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物 3. 55℃孵育30min 4. 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中 5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer 6. 于每管加入400ul苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min 7. 小心的吸取350ul上层水相,吸入另一新的enpendoff管 8. 于每管加入400ul氯仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min 9. 小心的吸取300ul上层水相,吸入另一新的enpendoff管 10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ,15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ,850ul 无水乙醇(无RNase),混合,-80℃保持1h至过夜 11. 14,000rpm,4℃离心30min,小心去上清 12. 用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,小心去上清,空气中晾干. 13. 10-20ul DEPC水溶解,-80℃保存,送测序

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作者:广州赛诚生物 点击:
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