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4.3 RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP)实验常见问题

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摘要 : 1:RIP试验需要注意什么? (1)防止RNA与蛋白非特异性结合。(2)避免RNA蛋白质结合被破坏。 (3)避免外源RNase污染。 (4)抑制内源RNase的活性。 (5)选择适合做RIP的抗体。 (6)避免RNA结合蛋白的降解。 2:为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白? (1)先进行IP或者WB,测试抗体可以与目标RBP结合。 (2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。 (3)尽可能选用密理博RIPAb+抗体。 (4)稀释抗体成浓度梯度,进行IP测试。 (5)4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。 (6)确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。 3:提取RNA时,蛋白酶K消化不完全是什么原因? 当进行蛋白酶K消化时,确保水浴温度应设置在55℃左右,长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。 4:提取RNA后,A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因? (1)需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。 (2)测试提纯后RNA中是否存在RNA酶,可能RNA发生了降解。 5:做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数
1:RIP试验需要注意什么? (1)防止RNA与蛋白非特异性结合。(2)避免RNA蛋白质结合被破坏。 (3)避免外源RNAse污染。 (4)抑制内源RNase的活性。 (5)选择适合做RIP的抗体。 (6)避免RNA结合蛋白的降解。 2:为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白? (1)先进行IP或者WB,测试抗体可以与目标RBP结合。 (2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。 (3)尽可能选用密理博RIPAb+抗体。 (4)稀释抗体成浓度梯度,进行IP测试。 (5)4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。 (6)确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。 3:提取RNA时,蛋白酶k消化不完全是什么原因? 当进行蛋白酶K消化时,确保水浴温度应设置在55℃左右,长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。 4:提取RNA后,A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因? (1)需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。 (2)测试提纯后RNA中是否存在RNA酶,可能RNA发生了降解。 5:做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数,想知道如果用蛋白浓度的话,大概在什么数量范围的蛋白总量对应50 ul BEADS? 50 ul beads对应的是一个reaction,而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清(2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到),所以只需要在裂解前计数一下,并按括号中的比例加入裂解buffer,后续100 ul 裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。 6:RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗? 理论上,可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本,再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase,以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。 7:因为RIP做完得到的是RNA序列,要做后续检测,比如测序、判断目标序列位置等,是不是都必须要做RT-PCR,得到逆转录的DNA后,后面就跟ChIP相同了? 常见的用real time qRT-PCR。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量,理论上说,使用input作为判别,计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看IgG以及目的抗体富集的非特异性mRNA的量的话,那么可以找一个确定不会与目的抗体结合的RNA片段设计primer进行qPCR,用来看IgG以及目的抗体拉下来的背景情况。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等)

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作者:广州赛诚生物 点击:
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